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熒光定量PCR具有一定的重現(xiàn)性

更新時間:2022-06-01      點擊次數(shù):1108
  熒光定量PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。開始時,探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,檢測不到熒光信號;PCR擴增時,Taq酶將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
 
  熒光定量PCR擴增反應的循環(huán)里,熒光信號變化不大,接近一條直線,這樣的直線即是基線,這條線是可以自動生成也可以手動設置的。之后反應會進入指數(shù)增長期,這個期間擴增曲線具有高度重復性,在該期間,可設定一條熒光閾值線,它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上,但一般會將熒光閾值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值,這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系,且該值具有重現(xiàn)性。
 
  熒光定量PCR特點有:
  (1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴增產(chǎn)物的量,進行實時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測,避免終點定量的不準確性,并且消除了標本和產(chǎn)物的污染,且無復雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。
  (2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA,或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得,打打提高了檢測的靈敏度、特異性和準確性。Real-timeO-PCR可以應用于mRNA表達的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細胞因子的表達分析、腫瘤耐藥基因表達的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測。
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